遗传毒性杂质专栏——遗传毒性杂质风险评估简析（下）

编者按：《遗传毒性杂质专栏——遗传毒性杂质风险评估简析（上）》中介绍了遗传毒性杂质的法规发展历程以及风险评估中的遗传毒性结构评估等。下篇将重点介绍不同类别遗传毒性杂质可接受摄入量计算方式等。

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第三步，当完成上述文献检索或软件评估过程后，需要根据检索/评估的结果，即是否具有明确的致突变和致癌性数据，对各化合物进行分类，具体分类标准和M7推荐的控制策略见表2^[2]。

表2 ICH M7 化合物致癌性和致突变性分类

分类	定义	拟定的控制措施
1	已知致突变致癌物	控制不超过该化合物特定的可接受限度
2	致癌性未知的已知致突变物（细菌致突变阳性，但无啮齿动物致癌性数据）	控制不超过可接受限度（合适的TTC）
3	有与原料药结构无关的警示结构，无致突变数据	控制步超过可接受限度（合适的TTC）或进行细菌只突变试验；无致突变性，归为5类；有致突变性，归为2类
4	有警示结构，且与经测试无致突变性的原料药及其相关化合物（例如，工艺中间体）具有相同的警示结构	按非致突变杂质控制
5	无警示结构，或虽有警示结构但有充分的数据证明无致突变性或无致癌性	按非致突变杂质控制

上述不同类别遗传毒性杂质可接受摄入量计算方式不同，一般可用法规公布的数据、以线性机制为基础的AI计算方法、以阈值机制为基础的PDE（Permitted Daily Exposure，每日允许暴露量）计算方法、TTC和分期TTC（属于AI计算方法的一种）、其他安全性数据等计算获得。

1）法规公布的限度

ICH M7公布了部分化合物的可接受摄入量^[2]，详见表3。FDA公布了亚硝胺类化合物的可接受摄入量^[7]，详见表4。

表3 ICH M7中的部分化合物可接受摄入量（2-1）

表3 ICH M7中的部分化合物可接受摄入量（2-2）

表4 FDA公布的亚硝胺类化合物可接受摄入量

注：当只含有1个N-亚硝胺类杂质时采用上述AI值计算限度，
含有2个及以上时总AI值应为26.5ng/天。

2）AI计算方法

如果杂质具有足够的致癌性数据，且非阈值机制，可以采用啮齿类动物的TD₅₀值通过线性外推计算化合物的AI值。TD₅₀可从CPDB数据库或第二步文献检索中直接获得，也可使用与CPDB相同方法从已发表的研究中自行计算获得，ICH M7文末举例了具体的计算方式^[8-9]。TD₅₀的1/50,000相当于终生潜在发生肿瘤的风险为十万分之一。

3）PDE计算方法

PDE的计算在残留溶剂和元素杂质中就有广泛运用，当杂质致突变致癌作用机制为阈值机制时，可通过NO(A)EL、LOEL和不确定因子来计算PDE值。

式中，F1为从不同物种外推到人的因子；

F2为个体差异因子；

F3为根据毒性暴露周期采用的可变因子；

F4为根据毒性严重情况采用的可变因子；

F5采用NO(A)EL时，一般为1，采用LOEL时，根据毒性严重程度确定，最高为10。

PDE的具体计算在ICH Q3C和Q3D中有详细举例，式中参与计算的NO(A)EL和LOEL值单位为mg/kg/天，采用第二步文献检索时，有时候获得的NO(A)EL和LOEL值为吸入研究的结果，单位是ppm，需要结合种属体重和呼吸量转换为mg/kg/天。F1~F5的具体数值需要结合获得NO(A)EL和LOEL值的长期（慢性）动物试验过程来确定。此处注意大鼠（rat）和小鼠（mouse和mice）的区别。进行第二步文献检索时，可在IRIS、HSDB、ITER等检索到NO(A)EL和LOEL值。

有时候NO(A)EL和LOEL值较难获得时，也有采用LD₅₀（50%动物致死量）计算NOEL值的情况存在，具体公式如下：

这个公式来自于APIC《Guidance on Aspects of Cleaning Validation in Active Pharmaceutical Ingredient Plants》^[10]，式中NOEL单位为mg/天，70kg为欧洲人体重，2000为口服剂型的原料药安全系数，获得的NOEL值进一步用于MACO（Maximum Allowance Carryover，允许最大残留）计算，而不是PDE计算。LD₅₀为急性毒性试验结果，NOEL为长期（慢性）毒性试验结果，D.W.Layton等研究过从LD₅₀→NOEL的可行性^[11]，但是LD₅₀→NOEL→PDE的过程在残留溶剂、元素杂质、遗传毒性杂质等的可接受摄入量的计算中本身存疑较多，不建议使用。

目前一般认为，致突变杂质直接引起DNA损伤，以线性机制为主，因此可接受摄入量计算更多还是以AI、TTC等为主，对阈值机制的研究较少，PDE计算方式的使用需要更多毒理学评估，明确阈值机制存在。

4）其他安全性数据计算可接受摄入量

除了TD₅₀、NO(A)EL、LOEL等毒理学数据，在第二步文献检索时也能获得化合物相应于十万分之一风险水平的饮用水限度（IRIS）、吸入剂量（IRIS）、MRL（ATSDR）、NSRL（CalEPA）、BMDL₁₀等可直接或进一步计算获得最终的可接受摄入量。注意，应以最新且具有科学支持的数据作为计算基础。

上述各数据推导可接受摄入量过程举例如下：

①当IRIS公布的某化合物相当于1/100,000风险水平的饮用水限度为0.1μg/L时，日饮用水量为2L/天（设定值），可接受摄入量为0.1μg/L×2L/天=0.2μg/天；

②当IRIS公布的某化合物相当于1/100,000风险水平的吸入暴露量为0.8μg/m³时，日呼吸量为20m³/天（设定值，有时候采用28,800L/天），可接受摄入量为

0.8μg/m³×20m³/天=16μg/天；

③采用MRL计算PDE：

PDE=MRL（mg/kg/天）×50kg，

或PDE=MRL(mg/m³)/1,000m³/L×28,800L/天

校正因子已经包含在MRL值中，PDE计算不需要安全系数。

用于元素杂质的可接受摄入量计算需要区分不同给药途径的MRL值，但是遗传毒性杂质除非存在特定给药方式问题（如肿瘤的部位特异性或化合物的强效接触位点致癌性），否则无需根据给药途径调整可接受摄入量，一般首选长期/慢性毒性试验得到的最低的MRL值。

④NSRL（如40μg/天）可以直接作为可接受摄入量；

⑤查阅的BMDL₁₀可以直接除以10,000线性外推至十万分之一风险发生率。

5）TTC或分期TTC

对于无毒理学研究数据的杂质可以采用TTC（单个杂质，1.5μg/天）作为可接受摄入量。TTC是从最敏感物种和肿瘤发生最敏感部位获得的TD₅₀（1.25mg/kg/天）线性外推至十万分之一风险发生率的剂量，通用于大部分药物。如果有2个2类或3类杂质，应制定每个杂质的可接受摄入量；如果质量标准中有3个及以上的2类或3类杂质，应按表5控制总可接受摄入量。其中1类杂质和制剂中形成的降解产物应单独控制，不计入总可接受摄入量。

短于终生给药的药品中致突变杂质的TTC值可调整为更高剂量，即1.5μg/天累积70年的总量（38.3mg）平均分配到短期的总给药天数中，具体调整见表5。间歇给药时应根据总给药天数计算。

表5 单个杂质和总杂质的TTC和分期TTC

治疗期	≤1个月	>1~12个月	>1~10年	>10年~终生
单个杂质TTC(μg/天)	120	20	10	1.5
多个杂质总TTC(μg/天)	120	60	30	5

从TD₅₀值推导的AI值，也可以根据给药周期，按照表5的比例同等放大短期给药的可接受摄入量，但不超过0.5%。举例，如果终生暴露时，某化合物可接受摄入量为15μg/天，短于终生暴露时限度可增加至100μg/天（＞1~10年治疗时长），200μg/天（＞1~12个月治疗时长）或1200μg/天（<1个月治疗时长）。但是，如果最大日服用剂量为100mg，则<1个月时长的每日可接受摄入量应为0.5%×100mg=500μg，而不是1200μg。此方法不适用于阈值机制的PDE放宽数值，但是对于短期暴露（≤30天），具体问题具体分析后，可以提高杂质可接受摄入量。

6）其他情况

对于与已知的某类致癌化合物在化学结构上相似的杂质，充分论证相似理由（结构相似，致癌致突变机理相似）后，可以按相似化合物的可接受摄入量计算。

如果某杂质通过其他途径（食品、内源性代谢物等）在人体中的暴露量更大，可接受摄入量可以提高；致突变代谢产物的限度制定通常需要结合体内遗传毒性研究结果制定，致突变制剂降解产物限度制定通常取决于长期稳定性试验结果。

参考药典收载的其他品种某遗传毒性杂质化合物的限度时需要注意，不可直接使用，应考虑该品种的给药周期和日服用剂量是否与待计算品种一致。

从上述各途径获得的杂质可接受摄入量（AI、PDE、TTC等）计算限度如下：

式中，药品最大日服用剂量来自药品说明书。

第四步，按上述步骤筛选出来的遗传毒性杂质或潜在遗传毒性杂质，应分析其在API、中间体或制剂产品中残留的可能性。遗传毒性杂质的亲电性使得它们一般具有一定化学反应活性，详见表6^[3]。在API合成工艺中，这些杂质可能在后续反应步骤中去除，也可能反应生成其他物质，最后残留在产品中的可能性较低。不过药监机构不太认可纯理论分析，在杂质控制策略中可以结合清除因子和检测结果证明产品或中间产品中的杂质残留情况。

表6 遗传毒性杂质按化学反应活性分类

化学反应活性	遗传毒性杂质结构类别
高活性	环氧化物、醛类、磺酸酯类、肼类、酰基卤化物、氮杂环丙烷
中等活性	硫芥类、氮芥类、迈克尔反应受体、卤代烯烃、
低活性	嘌呤、嘧啶、氨基甲酸酯类、芳香胺、硝基化合物

注：高活性指极易与亲核试剂反应。

为了量化分析杂质残留可能性，将杂质的物理化学性质和工艺过程结合起来，提出了清除因子（表7）的概念，数值越大，代表工艺清除的可能性越高。特定杂质在特定工艺流程中的总清除因子为各步清除因子的乘积。当清除因子大于10000时，杂质在API中的残留可能性极低，除非每日最大剂量在1g以上，否则可以不做相关控制；当清除因子在100~10000之间时，需要做加标实验证明工艺路线的清除能力；当清除因子在100以下时，说明杂质在最后或者倒数第二步引入，需要谨慎对待，并严格控制。^[3,12]

表7 物理化学性质与清除因子

物理化学性质	清除因子
化学反应活性	高活性=100 中等活性=10 低活性=1
溶解性	易溶=10 溶解=3 略溶或不溶=1
挥发性	杂质沸点比溶剂沸点低20℃以上=10 杂质沸点在溶剂沸点的±10℃范围内=3 杂质沸点在溶剂沸点的20℃以上或者不挥发=1
电离度	杂质的潜在电离度与API或基质明显不同=10
柱层析	杂质先于API洗脱=100 杂质后于API洗脱=10
重结晶	杂质在重结晶溶剂中易溶=100 杂质在重结晶溶剂中略溶=1
其他工艺流程，如树脂处理	具体情况具体分析

第五步，可能存在于API/制剂中的遗传毒性杂质，需要开展遗传毒性试验确认，通常是Ames试验，或者直接在各步控制在特定限度以下。

Ames试验结果为阴性时，按照普通杂质控制；Ames结果为阳性，但是杂质在产品或中间产品中能控制在特定限度以下，也可以接受；Ames结果为阳性，杂质在限度以上，可以进行体内遗传毒性试验，体内结果为阴性，按一般杂质控制；也可以重新评估工艺和路线，将杂质控制在限度以下；如果工艺控制不能将杂质水平降低至可接受限度以内，而杂质是ALARP水平，可以根据风险/收益分析合理提高杂质限度。

基于对产品和工艺的理解，以及风险管理原则，可将杂质控制点向上游移动，尽量减少终产品检测。ICH M7推荐4种API工艺杂质控制方法^[2]：

方法1：定入API质量标准（常规检测或定期检测）；

方法2：工艺上游控制-定入起始物料或中间体的内控标准；

方法3：工艺上游控制-定入起始物料或中间体的内控标准或过程控制，限度适当放宽，但是需要明确杂质去向和清除信息，并确认API中杂质始终控制在30%可接受限度内；

方法4：无需制定标准-明确工艺参数及其对残留杂质水平的影响，确信API中杂质存在风险可忽略不计（如1%TTC^[5]）。方法4适用于自身不稳定或工艺早期引入的可被有效清除的杂质，其可接受性由药监机构根据具体问题具体分析。

对于制剂降解杂质的控制，ICH M7建议根据降解试验（加速试验、光稳定性试验、强制降解试验、原辅料相容性试验等）评估降解途径与原料药和制剂的生产工艺和储藏条件的相关性，采取相应措施尽量控制致突变降解杂质产生和增长，杂质限度制定取决于长期稳定性试验结果。

各企业对遗传毒性杂质的研究和控制，可分类进行。同一类别杂质的致突变致癌作用机制、产生和清除机理、可接受摄入量制定、分析检测方法等有一定相似性，在项目运行过程中收集各品种的各类遗传毒性杂质信息，逐步建立企业自己的遗传毒性杂质库，在后续同类别遗传毒性杂质研究和控制中可以节约时间成本。

四、结语

在遗传毒性杂质的实际风险评估过程中，目前还大量存在根据文献^[13]公布的警示结构“目测”化合物（大部分时候所列出的杂质谱清单不齐全）是否具备潜在的遗传毒性，没有进行可靠文献检索和QSAR评估，根据“目测”的结果，结合用药周期和最大日服用剂量，采用TTC或分期TTC计算出杂质限度，开发相关方法，检测多批次样品，根据结果作出相应的工艺调整，如果调整不了，寻求放宽限度的方法以使产品合格，完成遗传毒性杂质评估。这种评估方式在欧美申报中是不被认可的，在国内申报中也将逐步退出历史舞台。

参考文献

1. 中国药典2020版四部通则9306 遗传毒性杂质控制指导原则.

2. ICH Harmonised Guideline: Assessment and control of DNA reactive (mutagenic) impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk(R1).2017.

3. Andrew Teasdale, et al. Genotoxic impurities strategies for identification and control. John Wiley & Sons, Inc.,2010.

4. Romualdo Benigni, et al.Mechanisms of chemical carcinogenicity and mutagenicity：A review with implications for predictive toxicology. Chemical Reviews 2011;111:2507-2536.

5. ICH Harmonised Guideline: Assessment and control of DNA reactive (mutagenic) impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk(R1), Questions and Answers. 2020.Version 29.

6. ICH Harmonised Guideline: Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use(R1).2011.

7. FDA Guidance for industry: Control of nitrosamine impurities in human drugs.2020.

8. David W. Gaylor, et al. Quick estimate of the regulatory virtually safe dose based on the maximum tolerated dose for rodent bioassays. Regulatory Toxicology and Pharmacology 1995; 22:57-63.

9. Charles Sawyer, et al. Calculation of carcinogenic potency from long term animal carcinogenesis experiments. Biometrics 1984; 40:27-40.

10. Active Pharmaceutical Ingredients Committee (APIC). Guidance on aspects of cleaning validation in active pharmaceutical ingredient plants. 2016.

11. D.W.Layton, et al. Deriving allowable daily intakes for systemic toxicants lacking chronic toxicity data. Regulatory toxicology and pharmacology 1987; 7:96-112.

12. Nevenka Kragelj Lapanja, et al. Theoretical purge factor determination as a control strategy for potential mutagenic impurities in the synthesis of drug substances. Acta Chimica Slovenica 2017; 64:1-14.

13. Romualdo Benigni, et al. Development of structural alerts for the in vivo micronucleus assay in rodents. JRC Scientific and Technical Reports 2009.

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